冷凍透射電子顯微鏡（cryo-TEM）結(jié)果顯示我們封裝的LNP-mRNA結(jié)構(gòu)完整且大小均一。

圖1 冷凍透射電子顯微鏡（cryo-TEM）視野下的LNP-mRNA。LNP保存于-80℃含有蔗糖的Tris溶液（pH7.4），冰上解凍后拍攝。比例尺=100 nm。 

動(dòng)態(tài)光散射（DLS）分析表明我們的LNP-mRNA可以達(dá)到很低的PDI值（PDI<0.1）。云舟生物承諾我們的LNP-mRNA的Zeta電勢(shì)范圍在-10 mV至+10 mV之間。 

圖2 LNP粒徑和Zeta電勢(shì)分析多分散指數(shù)（PDI）。（A）和Zeta電勢(shì)（B）通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)定。該方法可以測(cè)量粒子運(yùn)動(dòng)帶來(lái)的散射光強(qiáng)度的波動(dòng)變化。反映的則是樣本中的粒子尺寸的異質(zhì)性。樣本中的Zeta電勢(shì)范圍在-1.872到+1.872 mV之間。

圖3 使用LNP高效遞送mRNA。對(duì)比使用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑，LNP封裝的EGFP mRNA表現(xiàn)出更高遞送效率。向Jurkat和293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染1 ug的EGFP mRNA： （A）流式細(xì)胞術(shù)分析EGFP表達(dá)水平。（B）轉(zhuǎn)染后24 h拍攝細(xì)胞熒光圖片。實(shí)驗(yàn)中使用的EGFP mRNA均無(wú)核苷修飾。 熒光強(qiáng)度中值表示為MFI。

圖4 鼠轉(zhuǎn)導(dǎo)螢光素酶mRNA（Luc mRNA），檢測(cè)mRNA表達(dá)情況和免疫反應(yīng)。（A）注射后6 h、24h、和48 h通過(guò)活體成像檢測(cè)螢光素酶活性。 （B）為量化外源RNA在小鼠中引發(fā)的炎癥反應(yīng)，注射后48小時(shí)檢測(cè)小鼠血清中兩種促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的濃度。 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。小鼠種系：C57BL/6J；小鼠年齡：8周；注射方法：肌肉注射。（C）向Balb/C小鼠注射30 ug的LNP封裝的mRNA，注射后14天，分離Balb/C小鼠的脾臟細(xì)胞，針對(duì)病毒抗原A、病毒抗原B以及PBS對(duì)照進(jìn)行IFN-γ ELISpot試驗(yàn)。

圖5 EGFP mRNA轉(zhuǎn)染一級(jí)T細(xì)胞。（A）轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞數(shù)。無(wú)處理對(duì)照（NC）、商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑封裝的mRNA、以及LNP封裝的mRNA均分別轉(zhuǎn)染了一級(jí)T細(xì)胞。（B）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分比（灰色）和經(jīng)過(guò)量化的對(duì)應(yīng)的中位熒光強(qiáng)度（黑色）。

圖6 表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶（FLuc）的LNP-mRNA在偶聯(lián)anti-CD31抗體后在肺部的表達(dá)效率提升。小鼠品系：C57BC/6J ；小鼠年齡：6-8周；小鼠性別：雌性；注射途徑：尾靜脈注射；對(duì)照：IgG2a偶聯(lián)的Fluc-mRNA。

圖7 LNP配方優(yōu)化可提高質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染效率。（A）表達(dá)EGFP的質(zhì)粒（pDNA-CMV>EGFP）分別采用SM102和ALC-0315兩種LNP封裝，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h拍攝EGFP熒光圖像。（B）基于SM102優(yōu)化的配方可以獲得相較于商業(yè)化PEI轉(zhuǎn)染試劑高約6.6倍的轉(zhuǎn)染效率。該實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)粒（pDNA-CMV>Fluc）表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因。

圖8 采用云舟生物新型LNP配方封裝螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒（pDNA-CAG>Luc+），按照0.6 mg每千克體重靜脈注射小鼠。注射后96 h觀察螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)情況。