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在制藥產(chǎn)業(yè)，mRNA治療方法作為新型治療方案，在新冠疫苗研發(fā)以及腫瘤免疫治療方面具備非常大的發(fā)展?jié)摿蛻们熬?。近期，全球首款呼吸道合胞病毒（RSV）mRNA疫苗獲批上市，首個LNP-mRNA體內基因編輯療法公布積極長期數(shù)據(jù)等消息更是振奮了mRNA這條賽道。

眾所周知，質控方法和質量標準的研究是決定產(chǎn)品能否進入臨床研究以及順利上市的重要環(huán)節(jié)之一。美國藥典（USP）標準歷來被認為是一種重要的公共醫(yī)藥工具，2023年4月，USP重磅更新了新的一版《mRNA疫苗質量分析方法-指南草案》（后文簡稱“2023版草案”），2023版草案從整個mRNA疫苗產(chǎn)品的全生命周期出發(fā)，基于質量源于設計（QbD）的理念，涵蓋了包括DS和DP在內的表征和放行測試。

mRNA是一種單鏈RNA分子，可以形成二級結構（如發(fā)夾和R-環(huán)）和三級結構，并可能與其他mRNA分子發(fā)生相互作用從而形成聚集。而聚集體的存在可能會影響mRNA的穩(wěn)定性與活性。因此，在2023版草案中收錄了SEC-HPLC方法用于mRNA聚集體的定量測定方法。

近日，艾杰爾-飛諾美上海應用實驗室采用全新推出的Biozen dSEC-7色譜柱對全長約為4.5K nt的Cas9 IVT mRNA及其聚集體進行分離并定量。通過體積排阻色譜法（SEC）可以讓研究人員更好地理解和控制mRNA聚集體的形成，從而優(yōu)化mRNA的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質量。

為了盡可能保證mRNA構型的穩(wěn)定，此應用選擇了30℃的柱溫。并且在0.3 mL/min的流速下對比了多種流動相的表現(xiàn)。其中最有代表性的三種分別是2023版草案中收錄的SEC-HPLC推薦流動相150 mM磷酸鈉緩沖液，更高離子強度的流動相150 mM磷酸鈉緩沖液+100 mM氯化鈉，以及另一種對于核酸類樣品常用的SEC流動相體系50 mM Tris-Hcl緩沖液+250 mM氯化銨。

下圖展示了三種類型流動相的結果：

圖1 三種不同流動相下的峰形對比（綠色：150 mM磷酸鈉緩沖液+100 mM氯化鈉；紅色150 mM磷酸鈉緩沖液；藍色：50 mM Tris-Hcl緩沖液+250 mM 氯化銨）

表1 不同流動相積分結果比較

通過上述實驗證明飛諾美最新上市的700 Å孔徑SEC柱能夠很好的對大小約5K nt 的IVT mRNA樣品進行聚集體分離。事實證明，孔徑并非越大越好，優(yōu)化的孔徑分布更有利于聚集體分離。Biozen dSEC-7采用BioTi™生物惰性硬件，進一步降低了和生物大分子之間的次級相互作用，提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性，極少量的樣品即可獲得足夠的聚集體響應。實驗結果表明，該色譜柱適合mRNA聚集體的質量研究和放行檢測。

另外，SEC方法作為一種Native的分析方法，可以模擬出mRNA分子在不同的formulation中的原始狀態(tài)，輔助用于formulation的篩選工作。

作為基因遞送領域的領軍企業(yè)，云舟生物致力于為全球客戶提供高質量、高效率的基因遞送產(chǎn)品及服務。繼上次合作提供EGFP IVT mRNA樣品后，在此次研究中，云舟生物再次提供了關鍵樣品——Cas9 IVT mRNA，為研究提供了重要支持。CAS9作為新一代基因編輯技術，在疾病研究和治療中具有巨大的發(fā)展前景。此次項目也將進一步作為雙方合作的標桿示范項目，為雙方未來開展更多行業(yè)領先方法和工藝研究，包括AAV、mRNA和基因藥物載體平臺方案帶來更多合作空間。